Metodele moleculare de cercetare biologică și utilizarea acestora

Biologice moleculare metode de cercetare joacă un rol important în medicina modernă, știința medico - legale, și biologie. Datorită progreselor în studiul ADN-ului și ARN-ului, persoana este capabil să exploreze genomul organismului determina agentul cauzal, să recunoască acidul nucleic dorit într-un amestec de acizi, etc.

Metode moleculare-biologice. Ce este?

Înapoi în oamenii de știință de 70-80 a fost primul care a descifra genomului uman. Acest eveniment a dat un impuls pentru dezvoltarea ingineriei genetice si biologie moleculara. Studiul proprietăților ADN-ului și ARN-ului a însemnat că acum este posibilă utilizarea acestor acizi nucleici în scopul diagnosticării bolii, gena de studiu.

Prepararea ADN și ARN

moleculare biologice metode de diagnostic de multe ori acest lucru: necesită materie primă de acid nucleic. Există mai multe moduri de a selecta aceste substanțe din celulele organismelor vii. Fiecare are avantajele și dezavantajele sale, și ar trebui să fie luate în considerare la alegerea unei metode de izolare a acizilor nucleici în formă pură.

1. Prepararea ADN-ului de către Marmur. Metoda constă în tratarea amestecului de substanțe alcoolice, precipită rezultând ADN pur. Dezavantajul acestei metode este utilizarea substanțelor corozive, fenol și cloroform.

2. Izolarea ADN-ului pe brațul. Substanța principală care este utilizat aici - este tiocianat de guanidină (GuSCN). Acesta promovează depunerea acidului dezoxiribonucleic pe substraturi specializate, din care pot fi colectate ulterior prin intermediul unui buffer special. Cu toate acestea GuSCN - este un inhibitor al TCP, și chiar și o mică porțiune din care se depune in ADN-ul poate influența cursul reacției în lanț a polimerazei, care este important atunci când se lucrează cu acizi nucleici.

3. Precipitarea impurităților. Metoda diferă de cele anterioare, în care moleculele însele nu sunt depozitate acidul dehoksiribonukleinovoy și impurități. Pentru a face acest lucru, utilizați schimbătoarele de ioni. Dezavantajul este că nu toate substanțele se pot rezolva.

4. Screeningul de masă. Această metodă este folosită în cazurile în care nu este nevoie să aibă informații precise despre structura moleculei de ADN, precum și necesitatea de a obține unele statistici. Motivul este că structura de acid nucleic pot fi deteriorate în timpul manipulării detergenților, în special alcalii.

Clasificarea metodelor de cercetare

Toate metodele moleculare biologice ale cercetării sunt împărțite în trei grupe majore:

1. Amplification (utilizând o multitudine de enzime). Aceasta include PCR - reacția în lanț a polimerazei, care joacă un rol important în multe dintre metodele de diagnosticare.

2. Neamplifikatsionnye. Acest grup de metode este direct asociată cu activitatea amestecurilor de acid nucleic. Exemple sunt 3 tipuri blots, hibridizare in situ, etc.

3. Metodele bazate pe recunoașterea semnalului din molecula sondă, care se leagă la o probă de ADN sau ARN specifice. Soluție de sistem de hibridizare Hybride System Capture (hc2) - Exemplu.

Enzimele care pot fi utilizate în metode moleculare de cercetare biologică

Multe tehnici de diagnostic molecular implica utilizarea gama larga de enzime. Mai jos sunt folosite cel mai des:

1. enzimă de restricție - „tăiat“ molecula de ADN pentru piesele necesare.

2. ADN polimerază - sintetizeaza o molecula dublu catenară de acid dezoxiribonucleic.

3. Revers transcriptaza (revers transcriptaza) - utilizat pentru a sintetiza ADN-ul dintr-un șablon de ARN.

4. ligaza ADN - este responsabil pentru formarea de legături fosfodiesterice între nucleotide.

5. exonuclease - elimină nucleotide din porțiunile de capăt ale moleculei de acid dezoxiribonucleic.

PCR - metoda de bază de amplificare a ADN-ului

reacție în lanț a polimerazei (PCR) este utilizat pe scară largă în biologia moleculară modernă. Această metodă, în care o singură moleculă de ADN poate fi obținut un număr mare de copii (molecula de amplificare).

Principalele funcții ale PCR:

- diagnosticarea bolilor;

- clonarea segmente de ADN, Gene.

Pentru a realiza reacția de polimerizare în lanț necesită următoarele elemente: molecula de ADN initial, o ADN polimerază termostabilă (Taq sau Pfu), fosfați deoxiribonucleotide (surse de baze de azot), primerii (2 primer 1 moleculă ADN) și el însuși un sistem tampon care poate efectua toate reacțiile.

PCR este format din trei etape: Denaturarea, primerului și alungire.

1. Denaturarea. La o temperatură de 94-95 grade Celsius proshodit rupe legăturile de hidrogen între cele două lanțuri ale ADN-ului, și ca rezultat vom obține două molecule monocatenare.

2. primeri recoapte. La o temperatură de 50-60 de grade Celsius se produce grunduri de aderare la capetele moleculelor de acid nucleic mono-catenare în funcție de tipul de complementaritate.

3. Alungirea. La o temperatură de 72 de grade este fiica sintetizat dublu catenar molecule de acid dezoxiribonucleic.

secvențierea ADN

Metodele moleculare de cercetare biologică adesea necesită cunoașterea secvenței de nucleotide într-o moleculă de acid dezoxiribonucleic. Pentru a determina codul genetic secvențiat. Diagnosticare moleculare ale viitorului se va baza pe cunoștințele dobândite în determinarea secvenței umane.

Următoarele tipuri de secvențiere:

• secvențiere de Maxam-Gilbert;
• secvențierea Sanger;
• pirosecvențare;
• nanoporovoe secvențiere.